中國科學院物理研究所
北京凝聚態物理國家研究中心
SM6組供稿
第49期
2022年06月16日
人眼阻止紫外光損傷導致白內障的分子機制

  2022年5月26日,Biophysical Journal雜志在線報道了中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質物理實驗室翁羽翔課題組(SM6組)題為“熱誘導下α晶狀體蛋白發揮分子伴侶功能抑制γD晶狀體蛋白在紫外輻照下發生聚集沉淀的分子機制研究(The mechanism for thermal-enhanced chaperone-like activity of α-crystallin against UV irradiation-induced aggregation of γD-crystallin)”的工作。該工作與北京大學人民醫院鮑永珍課題組,深圳灣實驗室量子生物學高加力課題組合作,應用液相色譜-質譜聯用方法(LC-MS),傅里葉變換中紅外光譜(FTIR)與脈沖升溫(T-jump)納秒時間分辨中紅外瞬態光譜等手段,揭示了在水溶液中熱誘導促進α晶狀體寡聚體部分解離成單體,通過溶液中的α晶狀體單體分子和紫外輻照損傷的γD晶狀體單體分子結合,形成αγ異源二聚體。該異源二聚體在生理溫度條件下能夠自發地組裝到部分解離的α晶狀體寡聚體上,從而避免了紫外輻照損傷γD晶狀體間的聚集,后者的聚集體沉淀對入射光具有強散射效應,是導致白內障的成因之一。 由此提出了α晶狀體蛋白抑制紫外輻照損傷γD晶狀體蛋白發生聚集沉淀、實現其高效分子伴侶活性并防止紫外輻射導致白內障的分子機制。中科院物理所博士(北京大學深圳研究生院博士后,深圳灣實驗室訪問學者)李昊為論文的第一作者,翁羽翔和鮑永珍為共同通訊聯系人。

  白內障是全球首要的致盲性眼病,其中年齡相關性白內障是最主要的類型。隨著老齡化進程的加劇和我國龐大的人口基數,隨之增加的白內障患者數量對社會和家庭造成巨大的負擔,也嚴重影響老年群體的生活質量。北京大學人民醫院鮑永珍課題組在2003年至2005年對中國西部農村地區50歲及以上人群老年性白內障患病率調查結果顯示:青海(41.8%)、云南(48.2%)、貴州(18.8%)和廣西(39.4%)遠高于東部地區的白內障患病率。西南部地區由于海拔較高、緯度較低,紫外線輻射相對較高是造成這一結果的主要原因。紫外線輻照通常被認為是自然衰老過程中引起老年性白內障的主要危險因素,流行病學研究表明了這一觀點。


圖1. 左圖 透明晶狀體  右圖 混濁晶狀體(白內障)

  晶狀體是眼的主要屈光介質,晶狀體混濁即為白內障(圖1)。 晶狀體的最主要成分是晶狀體蛋白。晶狀體蛋白包含α、β和γ三大家族, 其中α-晶狀體蛋白占50%。α-晶狀體蛋白包括2 種亞型:αA( 173 氨基酸殘基) 和αB ( 175 氨基酸殘基)。正常的晶狀體中,晶狀體蛋白質分子排列有序,維持著晶狀體的高通光性。紫外線、高溫、臭氧等因素會引起蛋白質發生不可逆折疊,導致單體狀態如γ晶狀體蛋白發生聚集。一旦蛋白聚集體形成淀粉樣沉淀,晶狀體結構的有序性將遭到破壞,進而引發白內障等眼科疾病。α晶狀體蛋白在體外通常以30-50個單體聚集而成的寡聚體形式存在,并且在高于生理溫度條件下依然能夠保持透明性。單體間的結合面的分子結構見圖2A,B。α晶狀體蛋白作為一種重要的晶狀體結構組成蛋白外,還是一種小型熱休克蛋白(sHsp),具有分子伴侶的活性,有效抑制其他晶狀體蛋白發生損傷后聚集。盡管α晶狀體蛋白的分子伴侶活性早在20年前就被發現,但是其中涉及的分子機制卻一直沒有被揭示。其中的難點是在室溫條件下α晶狀體處于與其解離而成的單體所構成的動態平衡中,目前尚無法獲取α晶狀體寡聚體的X-射線晶體結構以及完整的冷凍電鏡結構。

  作為晶狀體的一種結構蛋白,γD晶狀體蛋白以單體的形式存在于晶體的內核且含量很高。其結構的熱力學穩定性依賴于四個保守的色氨酸(Trp)殘基(見圖2C)。正常情況下當紫外線到達晶狀體時,色氨酸間可以通過快速的能量轉移,將光能轉化為熱能,避免蛋白質分子發生光化學反應。然而,持續的紫外輻照依舊會導致肽鏈發生光化學裂解,這一光損傷過程也與活性氧有關。

圖2. α晶狀體蛋白與γD晶狀體蛋白結構示意圖。(A)和(B)分別是文獻報道的αA與αB晶狀體蛋白二聚體在中性環境中的冷凍電鏡結構示意圖。圖中用虛線標注二聚體界面處分子間氫鍵。(B)中重點突出αB晶狀體蛋白相鄰亞基之間R(Arg)107與D(Asp)80通過側鏈形成的氫鍵。(C)文獻報道的γD晶狀體蛋白單體結構示意圖。圖中標注4個保守色氨酸W(Trp),并放大W156-A158附近的蛋白質結構,其中,W156的吲哚環距離A158氨基氮原子的最短距離是4.14Å,該間距下W156自由基可以與A158的肽鏈發生能量傳遞。

  本項研究首先證實了α晶狀體蛋白對紫外輻照(325nm)損傷的γD晶狀體蛋白聚集過程具有遏制作用,并且該作用隨著溫度的升高而增大,如果沒有α晶狀體的參與,紫外輻照直接導致γD晶狀體蛋白變混濁并最終形成沉淀。 隨后應用疏水熒光探針分子證實α晶狀體蛋白和γD晶狀體蛋白的結合面發生在α晶狀體蛋白寡聚體熱解離后形成的疏水表面,并通過色譜方法在α晶狀體蛋白和經紫外輻照損傷γD晶狀體的混合物中分離出αγ晶狀體異源二聚體,并進一步應用原子力顯微鏡(AFM)和動態光散射(DLS)方法驗證了α晶狀體結合紫外損傷后的γD晶狀體的復合物(體積大于相同條件下單純的α晶狀體)。同時色譜-質譜聯用方法分析表明紫外輻照會造成處于α晶狀體蛋白保護下的γD晶狀體蛋白在C端Ala158位點發生共價鍵斷裂,掉下一段含15個氨基酸的肽鏈。

  通過變溫FTIR和T-jump納秒時間分辨中紅外瞬態光譜對熱誘導條件下α晶狀體蛋白的四級結構(單體組裝成寡聚物的結構)及二級結構(β片層,β彎折,無規卷曲等)進行研究?;谧儨刂屑t外光譜,實驗發現α晶狀體蛋白寡聚物會在熱誘導下解離出單體分子,這一過程與二聚體結合界面處分子間氫鍵的斷裂有關,并通過氨基酸單點突變的方法證實了1604 cm-1紅外吸收峰來自于二聚體結合界面處分子間氫鍵,并作為α晶狀體熱誘導解聚成單體過程的光譜指標。對于變溫紅外光譜,通過奇異值分解(Single Value Decomposition)方法,將α晶狀體蛋白在不同溫度區間內的中紅外光譜拆分為疏水性不同的三種組分:最外層親水組分,解離到溶液中的次親水的單體分子及α晶狀體蛋白解離后暴露出的疏水內殼層(圖3)。該模型與生物學家提出的疏水性呈梯度分布的三層核殼層模型一致:內核最疏水,第二層次之,最外層最親水。

圖3. α晶狀體蛋白三種不同組分的二階導數中紅外光譜與對應的熱滴定曲線。
(A) α晶狀體蛋白在25-64℃升溫過程中三個組分的二階導數中紅外光譜。包括內層最疏水組分(Component 1)、解離到溶液中的單體(Component 2)、以及外層最親水的組分(Component 3)。(B) α晶狀體蛋白三個組分在不同溫度下的布居數。

  據此,提出了如圖4B所示的α晶狀體蛋白抑制紫外光誘導γ晶狀體蛋白聚集的分子機制:紫外損傷的γD晶狀體蛋白與解離出的α晶狀體單體蛋白結合后形成αγ復合物,該復合物又與部分解離的α晶狀體蛋白寡聚物重新結合,進而阻止了因γD晶狀體蛋白之間聚集而導致的蛋白質沉淀。給出了α晶狀體蛋通過熱誘導解離成單體發揮其分子伴侶功能,實現對紫外誘導白內障的防護機制。然而α晶狀體對紫外輻照損傷γD晶狀保護作用是以γD晶狀體蛋白C端短肽的被紫外輻照截斷為代價的(見圖4A)。

圖4. 肽鏈裂解途徑與α晶狀體蛋白在熱誘導下保護底物γD晶狀體蛋白的示意圖。(A) 紫外輻照下,在γD晶狀體蛋白中由色氨酸(Trp)引發的肽鏈裂解途徑。
(B) 熱誘導下α晶狀體蛋白分子伴侶活性的機制示意圖。該機制發生的溫度區間是25-43℃,過程涉及單體脫離(Kd)、α晶狀體與D晶狀體單體間結合(Kb)及αγ復合物聚集到α晶狀體上(\(K_^{\gamma}\))。

  中科院物理研究所軟物質物理實驗室翁羽翔研究組,發展了脈沖升溫納秒時間分辨紅外光譜技術,致力于蛋白質動態結構與其生物功能研,在本項工作中,該方法揭示了單體間結合界面分子間氫鍵斷裂及其他二級結構變化的動力學過程。(Biophys. J. 2007, 93, 2756-2766, Rev.  Sci. Instr.  86 , 053105,2015)。在以往的工作中,闡明細菌了還原性二硫鍵異構酶(DsbC) 二聚體參與二硫鍵氧化通路異?,F象的分子機制(Biophysical Journal,97, 2811–2819, 2009); 觀測到大腸桿菌DegP熱休克蛋白通過“蛋白質地震 (Protein quake) ”模式實現由六聚體到三聚體的解聚動力學過程,闡明了環境溫度對激活DegP酶解活性的關鍵作用(Sci. Rep. 4, 4834-4840,2014);揭示了高等植物光系統II主要捕光天線蛋白色素復合物(Light Harvesting Complex II,LHCII)三聚體,作為蛋白質分子機器,是如何實現高效捕光和光保護功能間可逆切換的機理(Science China-Chemistry  63 , 1121-1133,2020)。

  該研究得到了國家自然科學基金委(21433014, 11721404和21173012)和中國科學院(QYZDJ-SSW-SYS017和YJKYYQ20170046)的支持。